Calcolatore di concentrazione proteica
Due modi per stimare la concentrazione proteica. (1) Beer–Lambert: inserisci il coefficiente di estinzione molare e la massa molare della tua proteina per convertire A280 in mg/mL. (2) A280 × 1 = mg/mL con l’ipotesi standard 1 A280 = 1 mg/mL, valida per campioni di proteine miste. Il calcolatore riporta anche una nota di purezza A260/A280.
Calcolatore
Inserisci una lettura e calcola per vedere la concentrazione
Concentrazione
c = A280 × dilution ÷ E(1 mg/mL) · c(M) = A280 × dilution ÷ ε
Quantificazione di Beer–Lambert: l'assorbanza a 280 nm è proporzionale alla concentrazione tramite il coefficiente di estinzione della proteina. In modalità molare il risultato è convertito anche in mg/mL usando il peso molecolare.
Informazioni su questo calcolo
Che cos'è
Proteins absorb at 280 nm because of aromatic residues (tryptophan, tyrosine, and to a lesser extent cystine). For a purified protein with a known molar extinction coefficient, Beer–Lambert gives an accurate concentration; for a mixed or unknown sample, the heuristic 1 A280 = 1 mg/mL is a usable estimate.
Perché si usa
Almost every downstream application — gel loading, dilution to a working stock, assay setup — needs a protein concentration. A280 is the fastest available measurement, but the assumption you make (1 mg/mL per A280 vs. Beer–Lambert) drives the accuracy of every result downstream.
Perché esiste questo calcolatore
A280 readings are often reported in instrument software, but converting them into a usable mg/mL number is where mistakes happen — particularly the missing division by path length or the wrong extinction coefficient. The calculator does the unit bookkeeping and shows both the 1-A280 and Beer–Lambert results side by side.
Ipotesi fondamentali
- The spectrophotometer was blanked with the same buffer the sample was diluted into.
- For the 1-A280 path, the protein mixture is roughly "average" (e.g. a crude lysate); for purified proteins use the calculated path.
- Path length is 1 cm, or the instrument has been corrected for a different path length.
Limiti
- The 1 A280 = 1 mg/mL assumption fails badly for samples rich in nucleic acids (use A260/A280 subtraction).
- It cannot detect proteins that lack aromatic residues or are present at sub-A280 noise-floor concentrations.
- It does not distinguish folded from denatured protein — the extinction coefficient assumes the folded environment.
Che cosa calcola
- Concentrazione mg/mL
- Protein concentration in the original (undiluted) sample.
- Concentrazione molare µM
- Molar concentration — shown in ε + molecular-weight mode.
Domande frequenti
Come calcolo la concentrazione proteica da una lettura A280?
Il calcolatore applica la legge di Beer–Lambert a un A280 corretto in bianco: dividi l'assorbanza per il tuo coefficiente di estinzione e moltiplica per il fattore di diluizione. Fornisci il coefficiente di massa E(1 mg/mL) per ottenere direttamente mg/mL, oppure il coefficiente molare ε insieme alla massa molare per ottenere sia mg/mL che µM. Inserisci 1 come fattore di diluizione per una lettura non diluita.
Devo usare E(1 mg/mL) o il coefficiente di estinzione molare?
Usa il coefficiente che effettivamente hai. E(1 mg/mL) è l'assorbanza di una soluzione 1 mg/mL con cammino ottico di 1 cm, quindi da solo fornisce la concentrazione in mg/mL — la BSA, per esempio, è circa 1,4. Il coefficiente molare ε in M⁻¹·cm⁻¹ richiede anche la massa molare in g/mol, ed è l'opzione che riporta anche la concentrazione in µM.
Cosa misura davvero il valore di A280 in un campione di proteine?
Le proteine assorbono la luce UV a 280 nm soprattutto tramite i residui di triptofano, tirosina e cistina, quindi l'assorbanza scala con la quantità di proteine nel cammino ottico. Questa relazione è fissa solo quando fornisci il coefficiente specifico della tua proteina, ecco perché il calcolatore chiede E(1 mg/mL) o ε. Il vantaggio è che il metodo richiede pochi microlitri e lascia il campione utilizzabile per il lavoro a valle.
Perché il risultato mostra sia mg/mL che µM, e quando usare ciascuno?
Entrambi compaiono quando lavori in modalità molare, perché la massa molare consente al calcolatore di convertire tra massa e quantità. mg/mL è l'unità pratica per diluire uno stock a una concentrazione di lavoro o caricare un gel, mentre µM conta quando la stechiometria molare guida l'esperimento, come nei saggi di legame o enzimatici. Nella modalità E(1 mg/mL) viene riportato solo mg/mL, non essendo stata inserita alcuna massa molare.
Cosa renderà errata la mia concentrazione proteica da A280?
La contaminazione da acidi nucleici gonfia l'A280 e spinge verso l'alto la concentrazione calcolata, quindi controlla il rapporto 260/280 del campione e correggi se necessario. Componenti del tampone che assorbono vicino a 280 nm, come DTT ad alta concentrazione, imidazolo o Triton, falsano anch'essi la lettura, quindi fai il bianco con lo stesso tampone. Il calcolatore presuppone un cammino ottico di 1 cm e un coefficiente adeguato alla tua proteina e al suo stato riducente, e non applica alcuna correzione di contaminazione propria.
Solo per uso didattico e di ricerca. Non destinato a decisioni cliniche o diagnostiche. Verificare sempre i calcoli in modo indipendente prima di usi critici.