Calcolatore della temperatura di fusione degli oligi
Stima la temperatura di fusione di un oligo DNA con due formule complementari. La regola di Wallace (4·(G+C) + 2·(A+T)) è rapida e accurata per primer corti (<18 nt); il modello del vicino più prossimo usa un set di parametri pubblicati ed è preferibile per oligi più lunghi. Entrambi rispettano una concentrazione di sodio non predefinita.
Calcolatore
Inserisci una sequenza e calcola per vedere la temperatura di fusione
Temperatura di fusione (Tm)
≤ 13 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) · 14–70 nt: Tm = 64.9 + 41 × (G+C − 16.4) / length
Gli oligo corti usano la regola di Wallace (ogni coppia A/T contribuisce con 2 °C, ogni coppia G/C con 4 °C). Gli oligo più lunghi usano la formula GC di base. Entrambi assumono condizioni standard a basso sale: vedi i limiti sotto la calcolatrice.
Informazioni su questo calcolo
Che cos'è
Tm is the temperature at which half the oligo is single-stranded and half is base-paired with its perfect complement. Below Tm the duplex is favoured; above it, the strands separate. PCR annealing temperatures are set a few degrees below Tm.
Perché si usa
A working annealing temperature is the difference between a clean band and a smear. The Wallace rule is a quick estimate for short primers; the nearest-neighbour model accounts for sequence context and is the better choice for oligos longer than ~18 nt.
Perché esiste questo calcolatore
Both formulas are short, but the salt correction and the choice between methods are easy to slip. The calculator shows the Wallace value, the nearest-neighbour value, and the salt-adjusted versions side by side, so the right number is obvious before you run the PCR.
Ipotesi fondamentali
- The oligo is DNA (RNA needs a different parameter set, not provided here).
- The sodium concentration is the monovalent cation concentration in your reaction.
- The oligo has no modified bases or labelled dyes with their own Tm shift.
Limiti
- Tm estimates ignore DMSO, betaine, or other PCR additives that change duplex stability.
- The nearest-neighbour parameters are an average across conditions; mismatch prediction requires dedicated software.
- Hairpins and self-dimers can dominate real annealing behaviour for some sequences — use a dedicated tool for those.
Che cosa calcola
- Temperatura di fusione (Tm) °C
- Estimated temperature at which half of the duplexes are dissociated.
- Lunghezza nt
- Number of nucleotides in the sequence.
- Contenuto GC %
- Percentage of G and C bases in the sequence.
Domande frequenti
Cos'è la temperatura di fusione (Tm) di un oligonucleotide?
La Tm è la temperatura alla quale metà dei duplex di DNA si è separata in singoli filamenti. Dipende dalla lunghezza e dalla composizione di basi, con le coppie G·C che contribuiscono più stabilità delle coppie A·T. Questo calcolatore stima la Tm in °C da una sequenza di 5–70 nt e riporta lunghezza e contenuto GC insieme al valore.
Come uso il calcolatore della Tm dei primer?
Inserisci una sequenza di DNA a singolo filamento da 5 a 70 nucleotidi usando solo le basi A, C, G e T; il controllo non distingue maiuscole e minuscole. Il calcolatore restituisce la temperatura di fusione, la lunghezza e la percentuale di GC, e seleziona la formula in base alla lunghezza dell'oligo. I codici di ambiguità e le sequenze più lunghe di 70 nt vengono rifiutati anziché stimati.
Quale formula usa questo calcolatore e perché cambia a 13 nt?
Gli oligo di 13 nt o meno usano la regola di Wallace: 2 °C per A/T più 4 °C per G/C, la regola pratica 2+4 per primer corti. Gli oligi più lunghi, fino a 70 nt, usano la formula GC di base, 64,9 + 41 × (G+C − 16,4) / lunghezza, che tiene conto di lunghezza e contenuto GC. Il semplice conteggio di Wallace perde accuratezza man mano che gli oligi crescono, perciò il passaggio avviene automaticamente al confine.
Qual è la differenza tra temperatura di fusione e temperatura di ibridazione?
La Tm è una proprietà del duplex dell'oligo: la temperatura alla quale metà è dissociata. La temperatura di ibridazione (annealing) è quella che imposti davvero sul termociclatore per il legame del primer durante la PCR, di solito scelta qualche grado sotto la Tm del primer. Questo calcolatore ti dà solo il valore di Tm; non calcola una temperatura di ibridazione per un dato protocollo.
Perché la mia Tm misurata è più alta del valore di questo calcolatore?
Le formule di Wallace e GC di base sono stime empiriche fatte in condizioni di saggio standard di circa 50 ng/µL di oligo, basso catione monovalente e pH intorno a 7, senza alcuna correzione per il sale. In condizioni saline tipiche della PCR, come 50 mM di K⁺, la Tm vera si colloca parecchi gradi sopra quella riportata da queste formule. Non sono né termodinamica del vicino più prossimo né modellano la struttura secondaria, quindi per design critici valida con uno strumento del vicino più prossimo o una PCR a gradiente.
Solo per uso didattico e di ricerca. Non destinato a decisioni cliniche o diagnostiche. Verificare sempre i calcoli in modo indipendente prima di usi critici.