Schmelztemperatur-Rechner für Oligos
Schätzen Sie die Schmelztemperatur eines DNA-Oligos mit zwei komplementären Formeln. Die Wallace-Regel (4·(G+C) + 2·(A+T)) ist schnell und genau für kurze Primer (<18 nt); das Nächster-Nachbar-Modell verwendet einen veröffentlichten Parametersatz und ist für längere Oligos vorzuziehen. Beide berücksichtigen eine von den Vorgaben abweichende Natriumkonzentration.
Rechner
Sequenz eingeben und berechnen, um die Schmelztemperatur zu sehen
Schmelztemperatur (Tm)
≤ 13 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) · 14–70 nt: Tm = 64.9 + 41 × (G+C − 16.4) / length
Kurze Oligos verwenden die Wallace-Regel (jedes A/T-Paar liefert 2 °C, jedes G/C-Paar 4 °C). Längere Oligos verwenden die einfache GC-Formel. Beide gehen von Standardniedrigsalzbedingungen aus — siehe die Einschränkungen unter dem Rechner.
Zu dieser Berechnung
Worum es geht
Tm is the temperature at which half the oligo is single-stranded and half is base-paired with its perfect complement. Below Tm the duplex is favoured; above it, the strands separate. PCR annealing temperatures are set a few degrees below Tm.
Warum man es verwendet
A working annealing temperature is the difference between a clean band and a smear. The Wallace rule is a quick estimate for short primers; the nearest-neighbour model accounts for sequence context and is the better choice for oligos longer than ~18 nt.
Warum es diesen Rechner gibt
Both formulas are short, but the salt correction and the choice between methods are easy to slip. The calculator shows the Wallace value, the nearest-neighbour value, and the salt-adjusted versions side by side, so the right number is obvious before you run the PCR.
Wichtige Annahmen
- The oligo is DNA (RNA needs a different parameter set, not provided here).
- The sodium concentration is the monovalent cation concentration in your reaction.
- The oligo has no modified bases or labelled dyes with their own Tm shift.
Einschränkungen
- Tm estimates ignore DMSO, betaine, or other PCR additives that change duplex stability.
- The nearest-neighbour parameters are an average across conditions; mismatch prediction requires dedicated software.
- Hairpins and self-dimers can dominate real annealing behaviour for some sequences — use a dedicated tool for those.
Was berechnet wird
- Schmelztemperatur (Tm) °C
- Estimated temperature at which half of the duplexes are dissociated.
- Länge nt
- Number of nucleotides in the sequence.
- GC-Gehalt %
- Percentage of G and C bases in the sequence.
Häufig gestellte Fragen
Was ist die Schmelztemperatur (Tm) eines Oligonukleotids?
Die Tm ist die Temperatur, bei der die Hälfte der DNA-Doppelstränge in Einzelstränge getrennt ist. Sie hängt von Länge und Basenzusammensetzung ab, wobei G·C-Paare mehr Stabilität beitragen als A·T-Paare. Der Rechner schätzt die Tm in °C aus einer Sequenz von 5–70 nt und gibt Länge und GC-Gehalt daneben an.
Wie verwende ich den Tm-Rechner für Primer?
Geben Sie eine Einzelstrang-DNA-Sequenz von 5 bis 70 Nukleotiden ein, die nur die Basen A, C, G und T verwendet; die Prüfung unterscheidet nicht zwischen Groß- und Kleinschreibung. Der Rechner liefert Schmelztemperatur, Länge und GC-Prozent und wählt die Formel anhand der Länge des Oligos. Ambiguitäts-Codes und Sequenzen über 70 nt werden abgelehnt, statt geschätzt.
Welche Formel verwendet dieser Rechner, und warum wechselt er bei 13 nt?
Oligos bis 13 nt verwenden die Wallace-Regel: 2 °C je A/T plus 4 °C je G/C, die 2+4-Daumenregel für kurze Primer. Längere Oligos bis 70 nt verwenden die einfache GC-Formel, 64,9 + 41 × (G+C − 16,4) / Länge, die Länge und GC-Gehalt berücksichtigt. Die einfache Wallace-Zählung verliert mit wachsenden Oligos an Genauigkeit, daher erfolgt der Wechsel automatisch an der Grenze.
Worin unterscheidet sich Schmelztemperatur von Annealing-Temperatur?
Die Tm ist eine Eigenschaft des Oligo-Doppelstrangs: die Temperatur, bei der die Hälfte dissoziiert ist. Die Annealing-Temperatur ist die Temperatur, die Sie am Thermocycler für die Primer-Bindung während der PCR tatsächlich einstellen, und sie wird meist einige Grad unter der Primer-Tm gewählt. Dieser Rechner liefert nur den Tm-Wert; er berechnet keine Annealing-Temperatur für ein bestimmtes Protokoll.
Warum ist meine gemessene Tm höher als der Wert dieses Rechners?
Die Wallace- und die einfache GC-Formel sind empirische Schätzungen unter Standard-Assay-Bedingungen von etwa 50 ng/µL Oligo, niedrigem einwertigem Kation und pH um 7; eine Salzkorrektur findet nicht statt. Unter typischen PCR-Salzbedingungen, etwa 50 mM K⁺, liegt die wahre Tm mehrere Grad über dem, was diese Formeln angeben. Sie sind außerdem keine Nächster-Nachbar-Thermodynamik und modellieren keine Sekundärstruktur, daher kritische Designs mit einem Nächster-Nachbar-Werkzeug oder einer Gradienten-PCR validieren.
Nur für Forschung und Lehre. Nicht für klinische oder diagnostische Entscheidungen. Prüfen Sie Berechnungen vor kritischen Anwendungen immer eigenständig nach.